PCR jeb polimerāzes ķēdes reakcija ir sarežģīta laboratorijas tehnika, ko plaši izmanto medicīnā un citās zinātnes jomās. PCR diagnostika savulaik kļuva par īstu sasniegumu zinātnē.
Apraksts
Kvantitatīvā PCR ir reāllaika PCR veids.
Ar to saprot PCR variantu, kurā pastāvīgi tiek fiksēta reakcijas kinētika, kas ļauj kvalitatīvi novērtēt specifisku DNS nukleotīdu secību saturu kompleksā molekulārā maisījumā.
Kvantitatīvā PCR metode tiks aplūkota sīkāk tālāk.
Analīzes būtība
Infekciju diagnosticēšanai īpaši bieži tiek izmantotas kultūras un seroloģiskās metodes. Pirmajā tiek noteiktas antivielas pret infekciozo patogēnu asins serumā. Otrajā bioloģiskais materiāls, kas ņemts no slima cilvēka, tiek izmantots, lai sētu noteiktu barotni, kas ir labvēlīga patogēnu koloniju augšanai. Diagnostika abāslieta var ilgt dienas vai nedēļas.
PCR izmeklēšanu var veikt ar dažādiem bioloģiskiem materiāliem, kas iegūti no slima cilvēka. Asinis un citi patoloģiski, fizioloģiski un bioloģiski līdzekļi un šķidrumi darbojas kā paraugi. Varat veikt PCR izkārnījumu vai urīnu.
Netipiskas un vīrusu infekcijas visbiežāk tiek diagnosticētas ar kvantitatīvo PCR, jo tās var nebūt viegli diagnosticēt to izraisītā patoloģiskā procesa specifiskā rakstura dēļ. Lai noteiktu šādas infekcijas, nepieciešams laiks, kura laikā organismā sāk ražot antivielas, ko nosaka ar seroloģiskām metodēm. Taču dažos gadījumos tas ir nepieņemami.
Izpildes metode
PCR metode - infekcijas laboratoriska noteikšana paraugos, kas izolēti no pacienta (in vitro).
Lai veiktu polimerāzes ķēdes reakciju, ir nepieciešams īpašu reaģentu komplekts.
Pārbaudāmo materiālu ievada mēģenēs ar reaģentiem. Mēģenes tiek ievietotas speciālā aparātā - PCR pastiprinātājā, kas paredzēts vēlamās RNS vai DNS fragmentu pastiprināšanai (skaita palielināšanai), PCR pastiprinātājs darbojas cikliskā režīmā. Jebkurā ciklā, ja paraugos ir patogēna RNS vai DNS secība, tad šķīdumā uzkrājas arvien vairāk šo nukleīnskābju daļiņu kopiju. Jūs varat noteikt patogēna klātbūtni un tā daudzumu paraugos.
PCR veidi
Kvalitatīvā analīze ar PCR ļauj iegūt šādu rezultātu:
- negatīvs, ja interesējošais patogēns paraugos nav atrasts;
- pozitīvs, ja paraugos tiek atrastas sekvences, kas raksturīgas konkrētam patogēnam.
Ar pozitīvu PCR rezultātu mēs varam runāt ar 95% precizitāti par diagnosticētas infekcijas esamību. Tajā pašā laikā diagnostikas nolūkos izmantoto PCR komplektu precizitāte sasniedz 100%.
Parasti 5% nepareizo rezultātu nosaka cilvēka faktors. Piemēram, analīzes un reaģentu uzglabāšanas tehnikas pārkāpumi var ievērojami samazināt pētījuma precizitāti.
Kvantitatīvā PCR definē vīrusu slodzes jēdzienu. Ir iespējams noteikt, cik patogēna DNS komplektu bija paraugos, kas ņemti no pacienta.
Infekcijas smagums ir tieši proporcionāls to skaita pieaugumam. Varat arī noteikt terapijas panākumus, lai samazinātu vīrusu slodzi.
Iesniegums PCR biomateriālam
Kvantitatīvā PCR tiek veikta klīnikā, galvenokārt no rīta. Vizītes laikā pie ārsta pacientam pastāstīs, kas ir jāņem: skrāpēšana, uztriepes, urīns vai asinis. PCR var noteikt patogēnus neatkarīgi no materiāla piesārņojuma līmeņa.
Lai iegūtu pozitīvu analīzi, teorētiski paraugos ir nepieciešams tikai viens patogēns. Praksē viņi cenšas radīt vēl labvēlīgākus apstākļus. Šim nolūkam ir daži ieteikumi:
- ja viņi paņem nokasīti vai iztriepi no dzimumorgāniemorgāni, trīs dienas pirms pētījuma ir jāatturas no intīmiem kontaktiem;
- nevar nomazgāties ar antibakteriāliem līdzekļiem vai nomazgāties pirms analīzes;
- trīs stundas pirms urīnizvadkanāla uztriepes ņemšanas jums jābūt pacietīgam un jāiztukšo zarnas.
Nododot asinis, neievērojiet šos noteikumus.
Kā tiek interpretēti kvantitatīvās PCR analīzes rezultāti?
Iegūto rezultātu kvantitatīvs novērtējums
Vairākās klīniskās situācijās parādās problēmas ar ārstēšanas efektivitāti un/vai patoloģijas procesa dinamiku. Šādi jautājumi ir īpaši aktuāli, izmeklējot cilvēkus ar hroniskām infekcijām (cilvēka imūndeficīta vīrusu, B un C hepatītu). Nosakot diagnozi, tās balstās uz faktu, ka amplikonu (PCR produktu) uzkrāšanās ir proporcionāla vēlamā gēna kopiju klātbūtnei analizētajā paraugā.
Protams, ņemot vērā kvantitatīvās PCR rezultātus, tiek veikta gēla elektroforēze ar īpašu PCR signālu intensitātes izpēti. Tāpat priekšnoteikums iegūto rezultātu pareizam kvantitatīvā novērtējumam ir pozitīvi uzticami kontroles paraugi, kas satur zināmu vēlamā gēna kopiju skaitu (piemēram, tūkstoš C hepatīta gēna kopiju vienai PCR reakcijai). Vairāki kvantitatīvās kontroles sērijveida atšķaidījumi ļauj ģenerēt kalibrēšanas līknes un tiek izmantotas, lai novērtētu klīnisko genokopiju saturu klīniskajos paraugos.
Kvantitatīvās PCR definīcijā galvenais sasniegums ir radīšanafluorescējošas DNS zondes, kuras pievieno reakcijas maisījumam vienlaikus ar vienkāršiem praimeriem un ļauj savlaicīgi izsekot PCR procesam, tas ir, reāllaika PCR.
TaqMan metodoloģija attiecas uz fluorescējošu DNS zondu sintēzi, kas ir raksturīgas amplikona vidusdaļai un kuru galos ir divas etiķetes. Viena no tām ir fluorescējoša etiķete, otrā ir šīs fluorescences slāpētāja molekula.
Īpaša ierīce, kas ir fluorimetra un termobloka pastiprinātāja hibrīds, veic pastāvīgus fluorescences mērījumus katrā mēģenē (reālā laika PCR princips). Pēc 20–40 PCR cikliem katram paraugam tiks iegūtas atsevišķas līknes. Vēlamā gēna kopiju skaitu, kas atrodas testa paraugā, var aprēķināt no kalibrēšanas līknēm ar kontroles paraugiem.
Tāpat svarīga iezīme PCR īstenošanā ar fluorescējošu metodi ir tāda, ka, ņemot vērā rezultātus, nav jāatver stobriņi ar PCR maisījumu. Tas samazina telpas piesārņojuma iespējamību ar pastiprināšanas produktiem, un nav nepieciešams piešķirt īpašas darba zonas elektroforēzei.
Ko parāda kvantitatīvais PCR transkripts?
Kas tiek atklāts?
Izmantojot tādu metodi kā kvantitatīvā PCR, tiek konstatētas kvalitatīvas izmaiņas gēnos: ievietošanas, dzēšanas un punktu mutācijas. Bet ar dažiem iedzimtiem traucējumiem attiecīgie simptomi parādās, reaģējot uz noteiktu gēnu satura izmaiņām.
PaldiesKvantitatīvā analīze dod skaitlisku rezultātu, visbiežāk SV / ml. Tas nozīmē, ka vienā mililitrā testa parauga tika atrasts noteikts skaits patogēna RNS vai DNS kopiju, mērot starptautiskajās vienībās.
Atkarībā no apjoma tiek diagnosticēta infekcijas smaguma pakāpe. Lai noteiktu vīrusu slodzi, parasti tiek pārbaudītas asinis, jo slimības laikā vīrusi asinīs brīvi pārvietojas.
Funkcijas
Kvantitatīvā PCR asins analīzē ir divas pazīmes.
- Analīzi veic primeru vai dezoksiribonukleozīdu trifosfātu klātbūtnē, kas ir marķēti ar fluorescējošu vai radioaktīvu marķējumu, lai precīzi noteiktu izveidotā PCR produkta saturu.
- PCR procesā pabeidziet reakciju agri, pirms parādās pārāk daudz PCR produktu. Tas ir saistīts ar faktu, ka pēdējā piesātinājuma stadijā, kad ir daudz PCR produktu, gan pats enzīms, gan substrāti darbojas kā šīs reakcijas ierobežojošās saites. Nākamā PCR cikla beigām šādos apstākļos vairs nav raksturīgs PCR produktu skaita dubultošanās, tiek izlīdzinātas nenozīmīgas kvantitatīvās atšķirības starp dažādiem paraugiem, kas ir diezgan skaidri noteiktas agrīnā stadijā pēc reakcijas ciklu sērijas iziešanas..
PCR diagnostikas izmaksas
PCR pētījumiem ir izmaksas, kas ir atkarīgas no tā, kāda veida infekcija tiks pārbaudīta, no analīzes metodoloģijas un testa materiāla. Lai noteiktu vienu infekciju, jums būs jāpadodas200-800 rubļi. Tiek pieskaitīta arī maksa par biomateriāla ņemšanu - aptuveni 400 rubļu.
