Plūsmas citometrija ir citoloģiskās izpētes metode, ko izmanto padziļinātai šūnu analīzei. Tās priekšrocība ir tā, ka tā ļauj izpētīt katru šūnu atsevišķi. Šāda veida analīze palīdz dažu sekunžu laikā novērtēt vairākus parametrus simtiem šūnu. Tā rezultātā citofluorimetrija tiek uzskatīta par vienu no ātrākajām un precīzākajām analīzes metodēm, kas pašlaik ir pieejamas zinātniekiem un ārstiem.
Princips
Plūsmas citometrijas princips ir balstīts uz šūnu gaismas izkliedes un luminiscences (fluorescences) mērīšanu. Šūnu suspensija lielā ātrumā tiek izvadīta caur citometra šūnu, kur tā tiek apstarota ar lāzeru. Tur tiek veikta arī tā sauktā hidrodinamiskā fokusēšana. Tās mehānisms ir tāds, ka plūsma no šūnas ar pētītajām daļiņām izejā ieplūst ārējā strūklā, kurai ir lielāks ātrums. Rezultātā daļiņas tiek sakārtotas sakārtotā ķēdē.
Priekššūnas ir marķētas ar īpašām fluorescējošām krāsvielām (fluorohromiem). Pateicoties viņiem, lāzera starsuzbudina sekundāru spīdumu. Saņemtos gaismas signālus reģistrē detektori. Pēc tam informācija tiek apstrādāta, izmantojot programmatūras algoritmus, kas ļauj saskaitīt atsevišķas šūnu populācijas, kas atšķiras pēc dažiem kritērijiem.
Pētījumos ar parasto mikroskopiju bieži neizdodas atšķirt dažādas šūnas, jo tās izskatās vienādi. Citofluorimetrija var nodrošināt citus datus (DNS struktūras integritāti), analizēt olb altumvielu ekspresiju, šūnu izdzīvošanu.
Tā kā fluorohromu ierosināšanai ir nepieciešami gaismas stari ar dažādu viļņu garumu, kā arī dažāda veida detektori, mūsdienu iekārtas ir aprīkotas ar vairākiem noteikšanas kanāliem (no 4 līdz 30). Lāzera izstarotāju skaits var būt no 1 līdz 7. Sarežģītākas ierīces ļauj veikt vairāku parametru pētījumus par vairākām daļiņu īpašībām vienlaikus.
Priekšrocības un trūkumi
Plūsmas citometrijas priekšrocības ietver:
- liels apstrādes ātrums (līdz 30 tūkstošiem notikumu reģistrēšana 1 sekundē);
- iespēja izpētīt lielu skaitu šūnu (līdz 100 miljoniem izlasē);
- fluorescējošās gaismas intensitātes kvantitatīva noteikšana;
- katras šūnas analīze;
- vienlaicīga heterogēnu procesu izpēte;
- automātiska datu atdalīšana pēc šūnu populācijām;
- kvalitatīva rezultātu vizualizācija.
Vēl viena šīs tehnoloģijas iezīme ir tāanalizēto daļiņu var iekrāsot ar vairākiem fluorescējošiem šķīdumiem. Pateicoties tam, tiek veikts vairāku parametru pētījums.
Trūkumi ir tehniskā aprīkojuma sarežģītība un nepieciešamība pēc īpašas paraugu sagatavošanas.
Citometri
Pirmās šāda veida ierīces parādījās jau 1968. gadā Vācijā, taču tās kļuva plaši izplatītas daudz vēlāk. Pašlaik visas ierīces, kas darbojas ar plūsmas citometrijas metodi, var iedalīt 2 veidos:
- ierīces, kas mēra fluorescējošu starojumu (divus vai vairāk viļņu garumus), 10° un 90° gaismas izkliedi (zema leņķa un sānu izkliedes detektors);
- ierīces, kas papildus vairāku mobilo sakaru parametru mērīšanai automātiski kārtojas grupās atbilstoši šiem kritērijiem.
Priekšējās izkliedes detektors ir paredzēts, lai noteiktu šūnas izmēru, un sānu izkliedes ierīce ļauj iegūt informāciju par intracelulāro granulu klātbūtni, citoplazmas un kodola tilpuma attiecību.
Klasiskie citometri, atšķirībā no gaismas mikroskopiem, neļauj iegūt šūnas attēlu. Tomēr pēdējos gados ir izstrādātas kombinētas ierīces, kas spēj apvienot mikroskopa un citofluorimetra iespējas. Tie tiks apspriesti tālāk.
Attēlveidošanas citometri
Instrumentiem, ko izmanto klasiskajā plūsmas citometrijā,ir raksturīga viena iezīme: ja analizējamo šūnu populācijā reģistrēti reti notikumi, tad nevar novērtēt, kāda ir to būtība. Šīs daļiņas var būt mirušu šūnu paliekas vai reta to grupa. Parastajās ierīcēs šādi dati tiek izslēgti no vispārējās notikumu plūsmas, taču tie var būt īpaši vērtīgi zinātniskajā un klīniskajā analīzē.
Jaunās paaudzes attēlveidošanas plūsmas citometri ļauj uzņemt attēlu no katras šūnas, kas iet plūsmā caur detektora zonu. To ir viegli redzēt, noklikšķinot uz atbilstošā diagrammas apgabala, kas tiek parādīta datora monitorā.
Lietošanas jomas
Plūsmas citometrija ir universāla metode, ko izmanto daudzās medicīnas un zinātnes jomās:
- imunoloģija;
- onkoloģija;
- transplantoloģija (sarkano kaulu smadzeņu, cilmes šūnu transplantācija);
- hematoloģija;
- toksikoloģija;
- bioķīmija (skābuma mērīšana šūnā, citu parametru izpēte);
- farmakoloģija (jaunu zāļu radīšana);
- mikrobioloģija;
- parazitoloģija un virusoloģija;
- okeanoloģija (fitoplanktona izpēte, lai novērtētu ūdenstilpņu stāvokli un citi uzdevumi);
- nanotehnoloģijas un mikrodaļiņu analīze.
Imunoloģija
Cilvēka imūnsistēma sastāv no visdažādākajām šūnām. Plūsmas citometrija imunoloģijā ļauj novērtēt to struktūru un funkcijas, tas ir, veikt morfofunkcionālusanalīze.
Šādi pētījumi palīdz izprast imunitātes sarežģīto raksturu. Šūnu fenotipi mainās antigēnu aktivācijas, patoloģiju attīstības un citu faktoru rezultātā. Citofluorometrija var atdalīt imūno šūnu apakšpopulācijas kompleksā maisījumā un novērtēt visas to izmaiņas laika gaitā.
Onkoloģija
Viens no svarīgākajiem uzdevumiem onkoloģijā ir šūnu diferenciācija pēc to veida. Plūsmas citometrijas analīzes princips onkohematoloģijā balstās uz šādu parādību: paraugu apstrādājot ar īpašu fluorescējošu krāsvielu, tas saistās ar citoplazmas olb altumvielām. Pēc sadalīšanās aktīvi proliferējošās šūnās tās saturs samazinās uz pusi. Attiecīgi šūnu luminiscences intensitāte samazinās divas reizes.
Ir arī citi veidi, kā noteikt proliferējošās šūnas:
- DNS saistošu krāsvielu (propidija jodīda) izmantošana;
- marķētā uracila izmantošana;
- ciklīna proteīnu paaugstināta ekspresijas līmeņa reģistrēšana, kas piedalās šūnu cikla regulēšanā.
