Rekombinantā DNS ir molekulas, kas izveidotas ar laboratorijas ģenētiskās rekombinācijas metodēm, lai apvienotu ģenētisko materiālu no vairākiem avotiem. Tas ir iespējams, jo visu organismu DNS molekulām ir vienāda ķīmiskā struktūra un tās atšķiras tikai ar nukleotīdu secību tajā.
Izveide
Molekulārā klonēšana ir laboratorijas process, ko izmanto, lai izveidotu rekombinanto DNS. Tā ir viena no divām visplašāk izmantotajām metodēm kopā ar polimerāzes ķēdes reakciju (PCR). Tas ļauj jums kontrolēt jebkuras konkrētas eksperimentētāja izvēlētās DNS sekvences replikāciju.
Ir divas būtiskas atšķirības starp rekombinantās DNS metodēm. Viens no tiem ir tāds, ka molekulārā klonēšana ietver replikāciju dzīvā šūnā, bet PCR ietver in vitro. Vēl viena atšķirība ir tā, ka pirmā metode ļauj izgriezt un ielīmēt DNS sekvences, bet otrā tiek uzlabota, kopējot esošo secību.
Vector DNS
Rekombinantās DNS iegūšanai nepieciešams klonēšanas vektors. Tas ir iegūts no plazmīdām vai vīrusiem un ir salīdzinoši neliels segments. Molekulārās klonēšanas vektora izvēle ir atkarīga no saimniekorganisma izvēles, klonējamās DNS lieluma un no tā, vai ir jāizpauž svešas molekulas. Segmentus var apvienot, izmantojot dažādas metodes, piemēram, restrikcijas enzīma/ligāzes klonēšanu vai Gibsona montāžu.
Klonēšana
Standarta protokolos klonēšana ietver septiņas darbības.
- Atlasiet saimniekorganismu un klonēšanas vektoru.
- DNS vektora iegūšana.
- Klonētas DNS veidošanās.
- Rekombinantās DNS izveide.
- Ievadot to saimniekorganismā.
- To saturošu organismu atlase.
- Klonu atlase ar vēlamajiem DNS ieliktņiem un bioloģiskajām īpašībām.
Pēc transplantācijas saimniekorganismā rekombinantajā konstrukcijā esošās svešās molekulas var tikt ekspresētas vai neizpausties. Ekspresijai ir nepieciešama gēna pārstrukturēšana, lai iekļautu sekvences, kas nepieciešamas DNS ražošanai. To izmanto saimniekdatora tulkošanas iekārta.
Kā tas darbojas
Rekombinantā DNS darbojas, ja saimniekšūna ekspresē proteīnu no rekombinantiem gēniem. Ekspresija ir atkarīga no tā, vai gēns ir apņemts ar signālu kopumu, kas sniedz norādījumus tā transkripcijai. Tie ietver promotoru, ribosomu saistīšanu un terminatoru.
Problēmas rodas, ja gēnssatur intronus vai signālus, kas darbojas kā baktēriju saimnieka terminatori. Tas noved pie priekšlaicīgas pārtraukšanas. Rekombinantais proteīns var būt nepareizi apstrādāts, salocīts vai degradēts. Tā ražošana eikariotu sistēmās parasti notiek raugos un pavedienu sēnēs. Dzīvnieku būru izmantošana ir apgrūtināta, jo daudziem ir nepieciešama spēcīga atbalsta virsma.
Organistu īpašības
Organismiem, kas satur rekombinantās DNS molekulas, šķietami ir normāli fenotipi. To izskats, uzvedība un vielmaiņa parasti nemainās. Vienīgais veids, kā pierādīt rekombinanto sekvenču klātbūtni, ir pārbaudīt pašu DNS, izmantojot polimerāzes ķēdes reakcijas testu.
Dažos gadījumos rekombinantajai DNS var būt kaitīga ietekme. Tas var notikt, ja tā fragments, kas satur aktīvo promotoru, atrodas blakus iepriekš klusējam saimniekšūnas gēnam.
Izmantot
Rekombinantās DNS tehnoloģija tiek plaši izmantota biotehnoloģijā, medicīnā un pētniecībā. Tās olb altumvielas un citus produktus var atrast gandrīz katrā Rietumu aptiekā, veterinārajā klīnikā, ārsta kabinetā, medicīnas vai bioloģiskajā laboratorijā.
Visbiežāk izmanto fundamentālos pētījumos, kur tehnoloģija ir būtiska lielai daļai mūsdienu darba bioloģijas un biomedicīnas zinātnēs. Rekombinanto DNS izmanto gēnu identificēšanai, kartēšanai un sekvencēšanai, kā arī to noteikšanaifunkcijas. rDNS zondes izmanto, lai analizētu gēnu ekspresiju atsevišķās šūnās un veselu organismu audos. Rekombinantos proteīnus izmanto kā reaģentus laboratorijas eksperimentos. Tālāk ir sniegti daži konkrēti piemēri.
Rekombinantais himozīns
Himozīns ir enzīms, kas nepieciešams siera pagatavošanai, un tas ir atrodams abomasum. Tā bija pirmā ģenētiski modificētā pārtikas piedeva, ko izmantoja rūpniecībā. Mikrobioloģiski ražots rekombinants enzīms, kas pēc struktūras ir identisks teļu izcelsmes enzīmam, ir lētāks un tiek ražots lielākos daudzumos.
Rekombinantais cilvēka insulīns
Praktiski aizstāts insulīns, kas iegūts no dzīvniekiem (piemēram, cūkām un liellopiem), lai ārstētu no insulīnatkarīgo diabētu. Rekombinanto insulīnu sintezē, ievadot cilvēka insulīna gēnu Eterichia ģints vai rauga baktērijās.
Augšanas hormons
Izrakstīts pacientiem, kuru hipofīze neražo pietiekami daudz augšanas hormona, lai atbalstītu normālu attīstību. Pirms rekombinantais augšanas hormons kļuva pieejams, to ieguva no līķu hipofīzes. Šī nedrošā prakse dažiem pacientiem ir izraisījusi Kreicfelda-Jakoba slimības attīstību.
Rekombinantais koagulācijas faktors
Šis ir asins recēšanas proteīns, ko ievada pacientiem ar hemofilijas formām ar asiņošanas traucējumiem. Viņi nespēj ražotVIII faktors pietiekamā daudzumā. Pirms rekombinantā VIII faktora izstrādes proteīns tika iegūts, apstrādājot lielu daudzumu cilvēka asiņu no vairākiem donoriem. Tas izraisīja ļoti augstu infekcijas slimību pārnešanas risku.
HIV infekcijas diagnostika
Katra no trim plaši izmantotajām HIV infekcijas diagnostikas metodēm tika izstrādāta, izmantojot rekombinanto DNS. Antivielu testā tiek izmantots viņas proteīns. Tas nosaka HIV ģenētiskā materiāla klātbūtni, izmantojot reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakciju. Testa izstrāde bija iespējama, veicot HIV genomu molekulāro klonēšanu un sekvencēšanu.
