Hromatogrāfija ir viena no vielu atdalīšanas metodēm. To izmanto turpmākai mikrodaļiņu fizikālo un ķīmisko īpašību kvalitatīvai un kvantitatīvai analīzei. Šīs tehnoloģijas variants ir afinitātes hromatogrāfija. Ideja diferencēt olb altumvielu savienojumus, izmantojot molekulārās afinitātes īpašību, zinātnē ir zināma vairākus gadu desmitus. Tomēr tas ir attīstījies tikai pēdējos gados pēc ļoti porainu hidrofilu materiālu ieviešanas, ko izmanto kā matricu. Šī metode ļauj atrisināt gan analītiskos uzdevumus (vielu atdalīšana un identifikācija), gan sagatavošanās uzdevumus (attīrīšana, koncentrēšana).
Essence
Afinitātes hromatogrāfija (no latīņu vārda affinis - “blakus esošais”, “saistīts”) balstās uz afinitātes mijiedarbību, kas ir ļoti specifisku saišu veidošanās starp starplikas molekulu (ligandu vai afinantu) un mērķa molekulu. Šie mehānismi dabā ir plaši izplatīti (mediatoru vai hormonu un receptoru savienojums, antivielas unantigēni, polinukleotīdu hibridizācija un cita veida procesi). Medicīnā afinitātes hromatogrāfiju praktiskiem nolūkiem izmanto kopš 1951. gada
Sastāvdaļas tiek atdalītas šādi:
- darba šķīdums, kas satur izolējamo vielu, tiek izvadīts caur sorbentu;
- ligands, kas nogulsnēts uz sorbenta matricas, saglabā šo vielu;
- tas ir koncentrēts (uzkrāšanās);
- izolētās vielas ekstrakcija no sorbenta, mazgājot ar šķīdinātāju.
Šī metode ļauj izolēt veselas šūnas. Atšķirība no tradicionālās sorbcijas hromatogrāfijas ir tāda, ka izolētajam komponentam ir spēcīga biospecifiska saistīšanās ar sorbentu, ko raksturo augsta selektivitāte.
Adsorbenti
Par adsorbentiem tiek izmantotas šādas vielas:
- Gēla savienojumi uz agarozes, no agara iegūta polisaharīda, bāzes. Visbiežāk tiek izmantotas 3 šķirnes: sefaroze 4B, CL (starpsaistītā agaroze) un affi-gel. Pēdējais sastāvs ir modificēta agarozes un poliakrilamīda želeja. Tam ir lielāka bioloģiskā inerce, augsta ķīmiskā un termiskā pretestība.
- Silīcija dioksīds (silikagels).
- Stikls.
- Organiskie polimēri.
Lai novērstu mehāniskus šķēršļus ligandu saskares laikā, tiek izmantotas papildu vielas, lai to atdalītu no nesēja (peptīdi, diamīni, poliamīni, oligosaharīdi).
Aprīkojums
Afinitātes hromatogrāfijas aprīkojumā ietilpst šādas galvenās vienības:
- uzglabāšanas tvertnes mobilajai fāzei (eluentam);
- augstspiediena sūkņi vidējai padevei (visbiežāk virzuļa virziena);
- filtrs eluentu tīrīšanai no putekļiem;
- dozēšanas ierīce;
- hromatogrāfiskā kolonna maisījuma atdalīšanai;
- detektors atdalītu komponentu noteikšanai, kas atstāj kolonnu;
- hromatogrammas ierakstītāji un mikroprocesora bloks (dators).
Lai samazinātu izšķīdušā gaisa daudzumu, hēlijs vispirms tiek izvadīts caur kustīgo fāzi. Lai mainītu eluenta koncentrāciju, tiek uzstādīti vairāki sūkņi, kurus kontrolē programmētājs. Hromatogrāfijas kolonnas ir izgatavotas no nerūsējošā tērauda (paaugstinātām prasībām pret koroziju), stikla (universāls variants) vai akrila. Sagatavošanas nolūkos to diametrs var svārstīties no 2 līdz 70 cm. Analītiskajā hromatogrāfijā izmanto mikrokolonnas Ø10-150 µm.
Lai palielinātu detektoru jutību, maisījumā tiek ievadīti reaģenti, kas veicina tādu vielu veidošanos, kas absorbē vairāk staru spektra ultravioletajā vai redzamajā apgabalā.
Metodika
Ir divi galvenie šķidruma afinitātes hromatogrāfijas veidi:
- Kolonna, kurā kolonna ir piepildīta ar stacionāru fāzi un caur to ar plūsmu tiek izvadīts maisījumseluents. Atdalīšanās var notikt zem spiediena vai gravitācijas.
- Plāns slānis. Eluents pārvietojas pa plakano adsorbenta slāni kapilāro spēku ietekmē. Adsorbentu uzklāj uz stikla plāksnes, keramikas vai kvarca stieņa, metāla folijas.
Galvenie darba posmi ietver:
- adsorbenta sagatavošana, liganda fiksācija uz nesēja;
- atdalīšanas maisījuma ievadīšana hromatogrāfijas kolonnā;
- mobilās fāzes ielāde, komponentu saistīšana ar ligandu;
- fāzes nomaiņa, lai izolētu saistīto vielu.
Galamērķis
Afinitātes hromatogrāfiju izmanto, lai izolētu šāda veida vielas (izmantotā liganda veids ir norādīts iekavās):
- enzīmu inhibitoru, substrātu un kofaktoru (enzīmu) analogi;
- bioorganiskas vielas ar ģenētiska svešuma pazīmēm, vīrusi un šūnas (antivielas);
- augstas molekulmasas ogļhidrāti, monosaharīdu polimēri, glikoproteīni (lektīni);
- kodolproteīni, nukleotidiltransferāzes (nukleīnskābes);
- receptori, transporta proteīni (vitamīni, hormoni);
- olb altumvielas, kas mijiedarbojas ar šūnu membrānām (šūnām).
Šo tehnoloģiju izmanto arī imobilizētu enzīmu iegūšanai, un to saistīšana ar celulozi ļauj ražot imūnsorbentus.
DNS saistošo proteīnu hromatogrāfija
DNS saistošo proteīnu izolēšana tiek veikta, izmantojotheparīns. Šis glikozaminoglikāns spēj saistīt plašu molekulu klāstu. Šīs grupas proteīnu afinitātes hromatogrāfiju izmanto, lai izolētu tādas vielas kā:
- translācijas ierosināšanas un pagarināšanas faktori (nukleīnskābju molekulu un proteīnu sintēze);
- restriktāzes (enzīmi, kas atpazīst noteiktas sekvences divpavedienu DNS);
- DNS ligāzes un polimerāzes (enzīmi, kas katalizē divu molekulu savienošanos, veidojot jaunu ķīmisko saiti, un ir iesaistīti DNS replikācijā);
- serīna proteāzes inhibitori, kuriem ir svarīga loma imūnsistēmas un iekaisuma procesos;
- augšanas faktori: fibroblasts, Švāns, endotēlijs;
- ārpusšūnu matricas proteīni;
- hormonu receptori;
- lipoproteīni.
Cieņa
Šī metode ir viena no specifiskākajām reaktīvo savienojumu (enzīmu un lielāku agregātu – vīrusu) izolēšanai. Tomēr to izmanto ne tikai bioloģiski aktīvo vielu izolēšanai.
Antivielu noteikšana nelielos daudzumos, poliadenilskābes kvantitatīvs novērtējums, ātra dehidrogenāžu molekulmasu noteikšana, noteiktu piesārņotāju noņemšana, tripsīna neaktīvās formas aktivācijas kinētikas, cilvēka molekulārās struktūras izpēte interferoni – tas nav viss pētījumu saraksts, kuros tiek izmantota afinitāte.hromatogrāfija. Izmantošana klīnikā ir saistīta ar tā priekšrocībām, piemēram:
- Efektīva tīrīšanas iespējaolb altumvielas, polisaharīdi, nukleīnskābes. Tie nedaudz atšķiras pēc to fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām un zaudē aktivitāti hidrolīzes, denaturācijas un cita veida apstrādes laikā, ko izmanto citās metodēs.
- Vielu atdalīšanas ātrums, procesa dinamiskais raksturs.
- Lai noteiktu disociācijas konstantes, nav nepieciešama īpaša fermentu attīrīšana un izoenzīmu homogenizācija.
- Spēja atdalīt plašu vielu klāstu.
- Mazs ligandu patēriņš.
- Iespēja atdalīt vielas lielos apjomos.
- Atgriezenisks bioloģisko makromolekulu saistīšanas process.
Šo paņēmienu var kombinēt ar citiem, lai uzliktu papildu lauku (gravitācijas, elektromagnētisko). Tas ļauj paplašināt hromatogrāfijas tehniskās iespējas.
Enzīmu inženierija
Pateicoties šai metodei, sākās aktīva jaunas biotehnoloģijas nozares - enzīmu inženierijas - attīstība.
Afinitātes hromatogrāfijai fermentu izolācijai ir šādas priekšrocības:
- enzīmu iegūšana lielos daudzumos mazāka laika rezultātā, kā rezultātā - to cenas samazinājums;
- enzīmu imobilizācija var būtiski paplašināt to pielietojuma jomu medicīnā un rūpniecībā;
- Enzīmu saistība ar nešķīstošu cieto nesēju ļauj pētīt mikrovides ietekmi un reakciju virzienu, kam ir svarīga loma dabas un fizioloģiskos procesos.
